SN∕T 5173-2021 国境口岸蜱传腹地病毒实时荧光RT-PCR检测方法
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ID： |
EF09545CDEC24A06A14EC19D9D145665 |
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文件大小(MB)： |
0.33 |
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10 |
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日期： |
2021-10-24 |
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准,SN/T 5173—2021,中华人民共和国海关总署发 布,ICS 11. 020,CCS C 62,2021-06-18 发布2022-01-01 实施,国境口岸蜱 传腹地病毒 实时荧光RT-PCR 检测方法,Real-time RT-PCR method for detecting Heartland Virus in ticks at frontier,ports,I,SN/T 5173— 2021,前 言,本文件按照GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第1 部分标准化文件的结构和起草规则》的规定,起草,本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口,本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国合肥海关、中华人民共和国重庆,海关、中华人民共和国扬州海关、中华人民共和国广州海关,本文件主要起草人：刘丽娟、石泉、骆星丹、王春、张晓龙、王静、慈颖、杨宇、郭天宇、戴俊,1,SN/T 5173— 2021,国境口岸蜱传腹地病毒,实时荧光RT- PCR检测方法,1 范围,本文件规定了国境口岸蜱传腹地病毒实时荧光RT-PCR 检测方法，包括样本前处理、检测程序、,方法、结果判定及报告,本文件适用于检验检疫机构对人及蜱携带腹地病毒的核酸检测,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文,件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）租,用于本文件,GB 19489 实验室 生物安全通用要求,SN/T 1293 国境口岸蜱类监测规程,WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用,人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 卫科教发〔2006〕15 号）,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1 腹地病毒 Heartland virus， HRTV,单股负链节段性RNA 病毒，属于布尼亚病毒科的白蛉病毒属，有S、M 和L 片段。其中，L 片,段编码RNA 依赖性RNA 多聚酶，M 片段编码糖蛋白Gn 和Gc，S 片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白,腹地病毒主要经蜱传播，经蜱叮咬后，人可出现发热及血小板减少等症状,3.2 逆转录聚合酶链反应 reverse transcription polymerase chain reaction ；RT-PCR,将RNA 逆转录（RT）和cDNA 聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用一步法逆转,录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在一步法RT-PCR 中，首先以RNA 为模板，利用下游特异性引物,在依赖RNA 的DNA 聚合酶（逆转录酶）作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步骤称作“逆转录”；,随后，再以cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA 聚合酶的作用下进行PCR 循环扩增；,最终使RNA 分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍,3.3 实时荧光RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR,是在常规RT-PCR 的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡聚核苷酸，两端分,别标记1 个荧光报告基团和1 个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸,收；PCR 扩增时，利用Taq 酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可以接收到荧光信号,2,SN/T 5173— 2021,4 缩略语,下列缩略语适用于本文件：,—— bp ：碱基对（base pair）；,—— Ct 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold）；,—— DEPC ：焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate）；,—— FAM ：6- 羧基－荧光素（6-carboxy-fluorescein）,5 检测对象,5.1 国境口岸现场采集的蜱虫样本,5.2 疑似被蜱虫叮咬且不能排除腹地病毒感染的人员,6 生物安全和PCR 防污染要求,按照GB 19489 和《人间感染的病原微生物名录》的要求，腹地病毒相关材料的生物安全要求如下：,——腹地病毒危害程度分类为第三类；,——未经培养的腹地病毒感染性材料的操作应该在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行；,——腹地病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；,——腹地病毒感染性材料运输和包装分为B 类，UN 编号为UN 3373,PCR 防污染措施按照WS/T 230 确定的规定执行,7 主要仪器,主要仪器设备如下：,——荧光定量PCR 仪；,——二级生物安全柜；,——高压灭菌器；,—— -70 ℃超低温冰箱；,——台式离心机；,——漩涡振荡器,8 主要试剂,主要试剂如下：,—— DEPC 水；,—— RNA 提取试剂盒：QIAamp Viral RNA kit，详见试剂盒说明书，内含AVL、AW1、AW2 和,AVE 等1）；,——一步法荧光RT-PCR 试剂盒：Ag-Path-IDTM one step RT-PCR kit1）；,——引物和探针：序列见表1,1） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产,品具有相同的效果，则可使用这些等效产品,3,SN/T 5173— 2021,表1 引物和探针序列,引物/ 探针名称序列（5’-3’） 扩增片段,F GTGAGAGCAAATACAATGA,R……
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